Biblioteka Ambrozjańska założona została przez kardynała Federico Borromeo, który w 1609 inaugurował publicznie swą kolekcję prywatną kodeksów greckich, łacińskich, średniowiecznych i orientalnych. Nazwano ją Ambrozjańską na cześć Św. Ambrożego patrona Mediolanu, wzbogaciła się o zbiory pochodzące z różnych lombardzkich instytucji religijnych, jak zakon benedyktyński z Bobbio, a także ze spadków kolekcjonerów prywatnych aż do XIX wieku.

Wzrastająca liczba i wartość kodeksów, obszerność kolekcji, uczyniło Bibliotekę Ambrozjańską jedną z najważniejszych na świecie: szczególnie ważnymi są zbiory arabskie i orientalne, kodeksy średniowieczne dzieł Plauto a przede wszystkim dzieła Virgilio i rękopisy autora Boccaccio, San Tommaso d'Aquino, Machiavelli, Ariosto, Tasso, Piero della Francesca, Pietro Bembo, Galileo Galilei aż do Parini i Beccaria. Bogata i cenna kolekcja "incunabuli" (pierwsze wydrukowane książki w cennym i limitowanym wydaniu) i wydania "principi" (pierwsze wydania absolune drukowane w różnych dziełach).

Do Biblioteki dołączona została w 1608 roku Galeria, która służyć miała jako podłoże powstającej Akademii Sztuk Pięknych, ukazującej wzorowy przykład do naśladowania, by dostosować się do dyrektorów Soboru w Trento. Akademię założono w 1621 roku i przez około wieku przeszła swą kwitnącą działalność przyciągając mistrzów i uczniów z całej Europy, by następnie chylić się ku upadkowi w czasach epoki Oświecenia, aż do definitywnego zamknięcia w 1776, kiedy zastąpiona została rodzącą się Akademią Brera.

Galeria natomiast przetrwała a nawet wzbogaciła się jeszcze bardziej, aż do aktualnych 1500 i więcej dzieł. Wśród obrazów najsławniejszych, są obecne dzieła Botticelli, Leonardo da Vinci, Raffaello, Luini, Tiziano, Barocci, Brueghel, Caravaggio. Poza tym wyróżniają się bogate kolekcje obrazów, między innymi te wyjątkowe mistrza Raffaello (ze szkicem Szkoły Ateńskiej) i Kodeks Atlantycki Leonarda da Vinci, z ponad 1700 rysunkami technicznymi i cechami naukowymi.