La Biblioteca Ambrosiana fu fondata dal cardinale Federico Borromeo, che nel 1609 aprì al pubblico la sua collezione privata di codici greci, latini, medievali e orientali. Chiamata Ambrosiana in onore di Sant'Ambrogio patrono di Milano, si arricchì di fondi provenienti sia da vari istituti religiosi lombardi, come il monastero benedettino di Bobbio, che da lasciti di collezionisti privati fino al XIX secolo.

Il numero elevato e il valore dei codici, la vastità delle collezioni rendono l'Ambrosiana una delle più importanti biblioteche al mondo: particolarmente importanti sono i fondi arabi e orientale, i codici medievali delle opere di Plauto e soprattutto di Virgilio, i manoscritti autografi di Boccaccio, San Tommaso d'Aquino, Machiavelli, Ariosto, Tasso, Piero della Francesca, Pietro Bembo, Galileo Galilei fino a Parini e Beccaria. Ricca e preziosa la collezione degli "incunabuli" (i primi libri mai stampati, in edizioni pregiate e limitate) e di edizioni "principi" (prime edizioni assolute in stampa di molte opere).

Alla Biblioteca fu affiancata nel 1608 la Pinacoteca, che doveva servire da supporto alla nascente Accademia delle Belle Arti, per mostrare il corretto esempio da seguire per conformarsi alle direttive del Concilio di Trento. L'Accademia fu fondata nel 1621 e per circa un secolo ebbe una fiorente attività attirando maestri e allievi da tutta Europa, per poi decadere durante l'età dell'Illuminismo, fino alla definitiva chiusura del 1776, quando fu sostituita dalla nascente Accademia di Brera.

La Pinacoteca però le sopravvisse e anzi andò arricchendosi sempre più, fino alle attuali 1500 e più opere. Tra i dipinti più famosi, sono presenti opere di Botticelli, Leonardo da Vinci, Raffaello, Luini, Tiziano, Barocci, Brueghel, Caravaggio. Si segnalano poi le ricche collezioni di disegni, tra cui spiccano quelli di Raffaello (con il cartone della Scuola di Atene) e il Codice Atlantico di Leonardo, con più di 1700 disegni tecnici e a carattere scientifico.